Eine der bedeutendsten und nachhaltigsten Trennungen ereignete sich jedoch während der Handlung von „One More Day“, die von Amazing Spider-Man #544-546 ablief im 2007 . In diesem Handlungsbogen macht Spider-Man einen Deal mit dem Teufel (in diesem Fall Mephisto), um Tante Mays Leben zu retten. Infolgedessen löscht Mephisto die Ehe von Peter Parker und Mary Jane Watson aus.
Diese Trennung hatte tiefgreifende Auswirkungen auf Spider-Mans Leben und seine Beziehung zu Mary Jane, und es dauerte Jahre, bis sie wieder Kontakt zueinander fanden und schließlich ihre Beziehung wieder aufleben ließen.
Obwohl es im Laufe ihrer Geschichte auch andere bedeutende Trennungen gab, wird die Handlung von „One More Day“ oft als die entscheidendste und nachhaltigste Trennung zwischen Spider-Man und Mary Jane angesehen.