Florey wurde in Adelaide, Südaustralien, als Sohn eines Schulleiters geboren. Er besuchte das St. Peter's College in Adelaide und die University of Adelaide, wo er 1921 seinen Bachelor of Science und 1924 einen Doctor of Medicine abschloss.
Nach Abschluss seines Medizinstudiums arbeitete Florey am Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research in Melbourne, wo er Ernst Chain kennenlernte. 1928 wechselten sie an die Sir William Dunn School of Pathology der Universität Oxford, wo sie mit der Entwicklung von Penicillin begannen.
Penicillin wurde 1928 von Alexander Fleming entdeckt, aber nicht zu einem brauchbaren Medikament weiterentwickelt. Florey und Chain gelang es, den Wirkstoff des Penicillins zu isolieren und zu reinigen, sodass er Patienten injiziert werden konnte. Sie entwickelten auch Methoden zur Massenproduktion von Penicillin, die eine breite Anwendung im Zweiten Weltkrieg ermöglichten.
Die Arbeit von Florey und Chain über Penicillin rettete im Zweiten Weltkrieg unzählige Leben und revolutionierte die Behandlung von Infektionskrankheiten. Florey erhielt 1945 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin und wurde 1944 zum Ritter geschlagen.
Florey war auch ein angesehener Administrator und Pädagoge. Von 1959 bis 1962 war er Vizekanzler der Universität Oxford und von 1960 bis 1965 Präsident der Royal Society of London. Außerdem war er Fellow der Australian Academy of Science und der American Academy of Arts and Sciences , und die Nationale Akademie der Wissenschaften.
Florey starb 1968 in Oxford an einem Schlaganfall. Er gilt als einer der bedeutendsten australischen Wissenschaftler des 20. Jahrhunderts und seine Arbeit über Penicillin hat Millionen von Leben gerettet.