Die Zeile „Schlaf nicht mehr!“ hat im Stück mehrere Bedeutungsebenen. Auf einer Ebene ist es einfach Macbeths Befehl an die gesamte Familie, wach zu bleiben und wachsam zu sein, da er befürchtet, dass etwas schief gelaufen ist. Die Linie hat jedoch auch eine tiefere Bedeutung und lässt die kommenden Ereignisse ahnen.
Erstens die Zeile „Schlaf nicht mehr!“ kann als Metapher für den Verlust der Unschuld und den Beginn von Macbeths Abstieg in die Dunkelheit gesehen werden. Bis zu diesem Punkt des Stücks hatte Macbeth mit seinem Gewissen zu kämpfen und zeigte Reue für seine Taten. Indem er jedoch den Satz „Schlaf nicht mehr!“ ausspricht, verbannt er effektiv den Schlaf und damit jede Chance auf Erlösung. Diese Zeile markiert einen Wendepunkt in Macbeths Charakter und symbolisiert seine Hingabe an das Böse.
Zweitens die Zeile „Schlaf nicht mehr!“ ist ein mächtiger Fluch, den Macbeth auf sich selbst und den gesamten Haushalt legt. Indem Macbeth sich selbst und den anderen die Fähigkeit zum Schlafen verweigert, erzeugt er einen Zustand ständiger Unruhe und Angst. Schlaf wird oft mit Frieden, Erholung und dem Unterbewusstsein in Verbindung gebracht, und indem er sich davon entzieht, bereitet Macbeth die Bühne für den mentalen und emotionalen Aufruhr, der darauf folgen wird. Der Satz deutet somit darauf hin, dass es keine Pause von den Schuldgefühlen, der Angst und der Paranoia geben wird, die Macbeth erlebt.
Drittens die Zeile „Schlaf nicht mehr!“ lässt die verstörende Schlafwandel-Episode ahnen, die Lady Macbeth später im Stück erleben wird. Als Macbeth zunehmend von seinen Schuldgefühlen zerrissen wird, beginnt Lady Macbeth unter Schlafwandeln und Albträumen zu leiden, während derer sie ständig den Satz „Raus, verdammter Ort!“ wiederholt. (Akt 5, Szene 1). Diese Zeile spiegelt in gewisser Weise Macbeths früheren Befehl wider und betont die Schlaflosigkeit und die seelischen Qualen, die das Paar befallen haben.
Abschließend lautet die Zeile „Schlaf nicht mehr!“ ist ein entscheidender Moment in Macbeth, der Macbeths Verwandlung in einen rücksichtslosen und von Schuldgefühlen geplagten Menschen signalisiert. Es fungiert als Metapher für den Verlust der Unschuld, als mächtiger Fluch und als Vorbote der zukünftigen Katastrophen, die Macbeth und seine Umgebung erwarten.